Ανάλυση όλου του γονιδιώματος WES και WGS

Αλληλούχιση επόμενης γενιάς

Η αλληλούχιση επόμενης γενιάς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διάφορα επίπεδα πολυπλοκότητας. Αυτά περιλαμβάνουν αλληλούχιση επιλεγμένων γονιδίων (πάνελ) που σχετίζονται με κάποια ασθένεια (Disease-targeted gene panel), αλληλούχιση των εξονίων όλων των γονιδίων του γονιδιώματος (Whole Exome Sequencing-WES) και αλληλούχιση όλου του γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing-WGS).

Με τη μέθοδο αλληλούχισης DNA νέας γενεάς NGS, και συγκεκριμένα με αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing, WGS), είναι δυνατόν να μελετηθούν με ακρίβεια τα σημεία θραύσης των γενετικών ανωμαλιών. Συγκεκριμένα, με τη μέθοδο WGS έχουν ανακαλυφθεί επιπρόσθετες χρωμοσωμικές πολυπλοκότητες που δεν μπορούσαν να ανιχνευτούν με τις παραδοσιακές κυτταρογενετικές μεθόδους.  Χρωμοσωμικές ανωμαλίες ορίζονται ως oι οποιεσδήποτε αλλαγές στον αριθμό (αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες) ή τη δομή των χρωμοσωμάτων (δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες). Οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες κατατάσσονται σε ανευπλοειδίες, όπως το σύνδρομο Down (Τρισωμία 21), και πολυπλοειδίες, όπως τριπλοειδίες, και τετραπλοειδίες. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες χωρίζονται σε 2 κατηγορίες, τις ισοζυγισμένες και τις μη ισοζυγισμένες. Στις μη ισοζυγισμένες περιλαμβάνονται οι αναδιατάξεις που οδηγούν σε αλλαγή στην ποσότητα του γενετικού υλικού όπως για παράδειγμα οι ελλείψεις και οι διπλασιασμοί και έχουν συνήθως επιπτώσεις στο φαινότυπο. Οι ισοζυγισμένες περιλαμβάνουν αναδιατάξεις που δεν προκαλούν προσθήκη ή απώλεια γενετικού υλικού. Παραδείγματα ισοζυγισμένων αναδιατάξεων είναι οι αναστροφές κατά τις οποίες ένα τμήμα του χρωμοσώματος αλλάζει φορά 180o και οι μετατοπίσεις όπου σημεία θραύσης σε χρωμοσώματα δημιουργούν τμήματα που μετατοπίζονται σε άλλα ομόλογα ή μη ομόλογα χρωμοσώματα. Η πιο συχνή κατηγορία ισοζυγισμένων αναδιατάξεων είναι οι μετατοπίσεις. Το μεγαλύτερο ποσοστό φορέων με φαινομενικά ισοζυγισμένες μετατοπίσεις είναι φαινοτυπικά υγιείς. Ωστόσο συχνά συναντώνται και ανώμαλα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά όπως νοητική υστέρηση, πολλαπλές συγγενείς ανωμαλίες και άλλες αναπτυξιακές ανωμαλίες. Επίσης, ισοζυγισμένες μετατοπίσεις μπορούν να μεταβιβαστούν στους απογόνους φορέων σε μη ισορροπημένη μορφή με αποτέλεσμα να γίνεται σύλληψη εμβρύων με ελλείμματα ή περίσσεια γενετικού υλικού ή να προκαλούνται πολλαπλές αποβολές

Οι τεχνολογίες αλληλούχισης επόμενης γενιάς έχουν αλλάξει δραματικά το πεδίο της μοριακής διαγνωστικής. Η αλληλούχιση των εξονίων του γονιδιώματος (WES) έχει εξελίξει τη βιοϊατρική έρευνα επεκτείνοντας τα αποτελέσματα και τις εφαρμογές στην κλινική διάγνωση. Περίπου το 1% του ανθρώπινου γονιδιώµατος αποτελούν οι κωδικοποιούσες περιοχές µε το 85% των µεταλλάξεων που προκαλούν ασθένειες να βρίσκονται στις περιοχές αυτές και σε λειτουργικές περιοχές του γονιδιώµατος. Για το λόγο αυτό ο προσδιορισµός της πλήρης αλληλουχίας των εξονίων του γονιδιώµατος δίνει τη δυνατότητα να αποκαλυφθούν τα αίτια µεγάλου αριθµού σπάνιων και ως επί το πλείστον µονογονιδιακών γενετικών διαταραχών καθώς και προσδιορισµό γενετικής προδιάθεσης για καρκίνο. Μέσω του WES μπορεί κανείς να αποκαλύψει νέες παραλλαγές που δεν είναι γνωστό ότι σχετίζονται με κάποια νόσο ή προκαλούν εξαιρετικά σπάνιες ασθένειες και να ταυτοποίησει παθογόνες παραλλαγές για ασθένειες οι οποίες δεν έχουν σχέση με το κύριο σκοπό της εξέτασης που ζητήθηκε (δευτερεύοντα ευρήματα). Επίσης, μπορεί να προσδιοριστεί η ύπαρξη φορείας για υπολειπόμενη ασθένεια, αλλά και φαρμακογενετικές παραλλαγές που μπορεί να επηρεάσουν την ανταπόκριση ενός ατόμου σε κάποιο φαρμακευτικό παράγοντα.

Η επιλογή των µελών της οικογένειας που θα αλληλουχηθούν και θα αναλυθούν επηρεάζεται από το µοτίβο κληρονοµικότητας που έχει βρεθεί για το συγκεκριµένο νόσηµα (επικρατές ή υπολειπόµενο) και αν άλλα µέλη της οικογένειας µε ή χωρίς παρόµοιο φαινότυπο είναι διαθέσιµα για ανάλυση. Σε µερικές περιπτώσεις µπορεί να είναι σηµαντικό να εξεταστούν µη προσβεβληµµένοι συγγενείς. Όταν υπάρχει υπόνοια για de novo παραλλαγή προτιµάται να εξετάζονται οι βιολογικοί γονείς του ασθενή και αν κανείς από τους δυο δεν την έχει τότε η παραλλαγή είναι σίγουρα de novo. Όταν υπάρχει υπόνοια για επικρατιτική ή υπολειπόµενη κληρονοµικότητα, οι γονείς, τα αδέλφια ακόµα και µακρινοί συγγενείς µπορούν να εξεταστούν ανάλογα µε το οικογενειακό ιστορικό, έτσι ώστε να µειωθούν οι πιθανές υποψήφιες παραλλαγές. Έτσι, η αλληλούχηση σε δύο προσβεβληµένα ξαδέλφια θα δώσει λιγότερες υποψήφιες παραλλαγές σε σχέση µε την αλληλούχηση σε δύο προσβεβληµένα αδέλφια. Σε άλλες περιπτώσεις, αλληλούχηση επόµενης γενιάς µπορεί να γίνει µόνο στο προσβεβληµένο άτοµο και γονοτύπηση ορισµένων παραλλαγών σε ορισµένους συγγενείς.

Γενετικοί Παράγοντες για την επιλογή των συγγενών προς εξέταση στην Αλληλούχησης Επόµενης Γενιάς.
Μελέτη για Αυτοσωµική Επικρατής Κληρονόµηση:
• Αν υπάρχει υποψία για de novo παραλλαγή του σχετιζόµενου γονιδίου µε τη διαταραχή να προκαλείται από ετερόζυγη (µονοαλληλική) µεταλλαγή, η δοκιµή µε µεγαλύτερη αξία είναι η ανάλυση σε τρίο που αποτελείται από ένα παιδί και τους δύο βιολογικούς γονείς.
• Αν αξιολογηθεί ένας φαινότυπος για αυτοσωµική επικρατή κληρονόµηση σε µια οικογένεια, αλληλούχηση δύο προσβεβληµένων συγγενών έχει µεγαλύτερη αξία από την αλληλούχηση δύο κοντινών συγγενών. Η ανάλυση των µακρινών συγγενών συνίσταται γιατί θα προκύψουν λιγότερες κοινές παραλλαγές να µοιράζονται.
Μελέτη για Αυτοσωµική Υπολειπόµενη Κληρονόµηση:
• Αν µελετάται η ύπαρξη αυτοσωµικού υπολειπόµενου γονιδίου τότε είναι χρήσιµη η δοκιµή σε τρίο, εξετάζοντας το παιδί και τους δύο βιολογικούς γονείς.
• Αν υπάρχει συγγένεια τότε η δοκιµή σε τρίο είναι λιγότερο χρήσιµη, επειδή η αλληλουχία του παιδιού θα έχει πολλές περιοχές οµοζυγωτίας.

Μιτοχονδριακό DNA

 Με τον υψηλό εξελικτικό ρυθμό και την απουσία ανασυνδιασμού, το μιτοχονδριακό DNA υπόκειται σε διαρκή γενετική διάβρωση λόγω μεταλλάξεων. Αν και είναι μικρό σε μέγεθος είναι υπεύθυνο για τη διασφάλιση της σωστής λειτουργίας των κυττάρων μας. Περιέχει 37 γονίδια που κωδικοποιούν 13 πρωτεΐνες, 22 μεταφορικά RNA και 2 ριβοσωμικά RNA. Οι 13 μιταχονδριακώς γονιδιακώς κωδικοποιημένες  πρωτεΐνες καθοδηγούν τα κύτταρα να παράγουν  πρωτεΐνικές υπομονάδες των συμπλεγμάτων ενζύμου του οξειδωτικού συστήματος φωσφορυλίωσης, το οποίο επιτρέπει στα μιτοχόνδριανα δρουν ως οι δυνάμεις των κυττάρων μας. Η ποικίλη φύση των μιτοχονδριακών ασθενειών υπογραμμίζει τους πολλούς ρόλους που παίζουν τα μιτοχόνδρια και το DNA τους όχι μόνο ως “εργοστάσια” παραγωγής ενέργειας αλλά και ως ρυθμιστές του ανοσοποιητικού συστήματος.

Τα μιτοχόνδρια συμμετέχουν σε μερικές από τις πιο ζωτικές λειτουργίες του ευκαρυωτικού κυττάρου

  • παραγωγή ATP μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης
  • ρύθμιση της πρόσληψης του ασβεστίου
  • απόπτωση (απομάκρυνση κυττάρων που εμφανίζουν βλάβες)
  • μεταβολισμό απαραίτητων συστατικών

Οι μιτοχονδριακές λειτουργίες και οι κυτταρικές λειτουργίες κατ’ επέκταση εξαρτώνται από τον σωστό συντονισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των προϊόντων των γονιδίων που προέρχονται από το πυρηνικό και μιτοχονριακό γονιδίωμα.

Επειδή τα μιτοχόνδρια ανευρίσκονται σε όλους τους ιστούς, τα σύνδρομα που σχετίζονται με μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA μπορεί να επηρεάσουν κάθε σύστημα του σώματος, συμπεριλαμβανομένου:

  • του οφθαλμού (οπτική ατροφία, μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια, καταρράκτης),
  • της ακοής (νευροαισθητήρια κώφωση),
  • των ορμονών (κοντό ανάστημα, σακχαρώδης διαβήτης, υποπαραθυρεοειδισμός),
  • της καρδιάς (οικογενείς μυοκαρδιοπάθειες, μπλοκ αγωγιμότητας),
  • του γαστρεντερικού σωλήνα (εξωκρινής δυσλειτουργία του παγκρέατος, εντερική ψευδο-απόφραξη, γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση),
  • του νευρικού συστήματος (αναπτυξιακές και ψυχιατρικές διαταραχές, άνοια),
  • του μυϊκού συστήματος (αδυναμία, υποτονία, επιληπτικές κρίσεις, μυϊκή πόνοι),
  • του ήπατος (υπογλυκαιμία, ηπατική ανεπάρκεια) και
  • των νεφρών (νεφρική σωληναριακή οξέωση, νεφρωσικό σύνδρομο).

Σημειακές μεταλλάξεις mtDNA γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες συχνά ξεφεύγουν των κανόνων της μιτοχονδριακής γενετικής στο ότι επηρεάζουν μεμονωμένα άτομα και ιστούς, συνηθέστερα σκελετικούς μυς. Έτσι, οι ασθενείς με δυσανεξία στην άσκηση, μυαλγίες, και μερικές φορές επαναλαμβανόμενη μυοσφαιρινουρία μπορεί να έχουν μεμονωμένες βλάβες.

 

Σύνδρομα που σχετίζονται με μιτοχονδριακές μεταλλάξεις

Σύνδρομο Γονίδιο
Γαλακτική οξέωση με επεισόδια τύπου εγκεφαλικού επεισοδίου (MELAS) MT-TL1, MT-ND3, MT-ND5, MT-CYTB
Χρόνια εξελικτική εξωτερική οφθαλμοπληγία (CPEO) MT-TV, MT-TL2
Kearns –Sayre (ΚSS) Εκτεταμένη έλλειψη μιτοχονδριακού DNA
MIDD (μητρικά κληρονομούμενος διαβήτης και κώφωση) MT-TL1,  MT-ND1
Μυοκλονική επιληψία (MERFF) MT-TK,  MT-ND5
NIDDM MT-RNR2, MT-TLI, MT-NDI, MT-ND6, MT-ND2
Κληρονομική οπτική νευροπάθεια Leber (LHON) MT-ND1, MT-CO3, MT-ND6, MT-ND4, MT-CYTB
LS MT-ATP6,  MT-ND6,  MT-ND4
NARP MT-ATP6
Καρδιομυοπάθεια, εγκεφαλομυοπάθεια MT-RNR1, MT-TV, MT-TLI, MT-TI, MT-CO2, MT-TK, MT-CO3, MT-TG, MT-TH, MT-TL2, MT-ND6, MT-CYTB
Pearson Εκτεταμένη έλλειψη μιτοχονδριακού DNA